卡西波肉瘤是一種發生在包括口腔在內的多種組織內的,具有*的血管生成能力和侵襲能力的惡性腫瘤??ㄎ鞑ㄈ饬鯧S已經被鑒定出多種細胞標記物,但是其來源依然是一個迷。美國的科學家之前發現卡西波肉瘤相關的皰疹病毒(KSHV)能夠使大鼠的原代間充質干細胞(MSCs)感染,變形,并且重新編輯,使其分化為類卡西波肉瘤細胞。在這次的實驗中,科研人員使用KSHV感染由多種組織來源的人原代間充質干細胞,包括骨髓(MSCbm),脂肪組織(MSCa),牙髓,牙齦組織(GMSC),和乳牙。科研人員成功的建立起來KSHV感染的MSCa,MSCbm和GMSC(LTC-KMSCs)的穩定株。其中,這些細胞表達了混合的KS標記物,并且顯現出不同的血管生成、侵襲和變形的現象,而LTC-KMSCs表現出比未感染細胞更低的增殖率。進而研究人員發現KSHV介導的血管生成是通過KSHV介導的microRNA激活了AKT通路。這些研究說明,在人體內MSCs是KSHV的靶細胞,會建立起多種KSHV感染的模型。
研究人員采用各種MSCs,鋪在基質膠上,孵育8小時,對比不同細胞的分枝數和節點數。
Thyroid Transcription Factor 1 Reprograms Angiogenic Activities of Secretome
L. Wood, N. Cox, C. Phelps, S. Lai, A. Poddar, C. Talbot and D. Mu
Scientific Reports, 2016, 10.1038/srep19857
(一)實驗材料和實驗方法
1)細胞: MSCs ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, CA) or Lifeline Cell Technology (Frederick, MD)
2)培養基: MSC medium (MSCM; ScienCell Research Laboratories)
3)基質膠: Matrigel Basement membrane (BD) 10 µl per well
4)耗材: ibidi血管生成載玻片 (ibidi, 81506)
5)其他: 細格紙
(二)實驗步驟
1)準備基質膠
① 將10μl的Basement membrane以5mg/ml的濃度鋪入ibidi血管生成載玻片的內孔中,注意槍頭要垂直于內孔的正上方加入Matrigel,防止有Matrigel流經上孔而留下殘留膠。
② 蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
③ 準備一個10cm的培養皿,放入浸過水的紙巾,制成一個濕盒。
④ 將ibidi血管生成載玻片放入培養皿中,蓋上培養皿蓋。
⑤ 37℃至少孵育30分鐘,使基質膠固化。
怎么知道加了合適體積的Matrigel:
由于Matrigel流動性不強,并且有可能移液槍不準確,有可能10μl的膠不能填滿ibidi血管生成載玻片的下孔,這樣,必然會影響到實驗的成像結果。這時用一張格子紙就能知道移液槍調整到多少能正好把下孔填滿。
如上圖所示,垂直透過每個孔看下面的格子紙,如果格子被縮小了,那么就說明膠沒加滿,格子被放大了,那么膠就加多了,格子沒發生什么變形,這才是剛剛加滿下孔的狀態。
3)鋪細胞
① 每孔種10000個細胞即可。準備密度為2*105cells/ml的細胞懸液,充分混勻。
② 將膠已經凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
③ 每孔加入50μl的細胞懸液,注意保持槍頭垂直在上孔的上方,不要接觸下孔的凝膠??梢允褂门艠尅?/span>
④ 同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體,如果沒有,加入無細胞的培養基,使上孔液體正好加滿。
⑤ 蓋上蓋,靜置,一段時間后,所有細胞都會沉下去落在Matrigel的表面。
4)采集圖像并統計結果
37度 5% CO2孵育8小時后,使用尼康Eclipse E400熒光顯微鏡采集圖像,并其分枝數和節點數進行測量和統計。
三)實驗結果
對比LTC-KMSCs幾種細胞的成管效果。Mock是未被病毒感染的間充質干細胞,KSHV會增強血管形成效果。圖像是鋪細胞后8小時采集,100倍放大倍數。