ibidi血管生成實驗實驗裝置優化和數據分析操作
µ-Slide 血管生成載玻片
1.選擇正確實驗方案
進行血管形成分析的第一步是確定實驗方案。需要考慮三個最重要的考慮因素,分別是:
· 細胞類型——內皮細胞中生理性地觀察到管形成
· 凝膠基質——它需要與細胞相容,并且必須為細胞附著提供結合基序
· 培養基成分(要求生長因子)
2.實驗前工作
在開始篩選實驗之前,務必要做優化實驗程序和設置。
2.1. 實驗裝置的優化
細胞接種密度、數據采集時間點和血清濃度對數據值有很大影響。因此,創建嚴格對于生成可重復的數據和數據集之間的可比性至關重要。
2.1.1. 測量時間間隔
首先,選擇細胞濃度和促進血管形成的設置來記錄時間曲線。對于人臍靜脈內皮細胞 (HUVEC) 每孔約 10,000 個細胞,使用具有減少生長因子的基質膠TM值和不含血清或生長因子的細胞培養基就足夠了。
接下來,按照應用說明制備凝膠和細胞懸液,“ibidi µ-Slide 血管生成的形成分析"。在凝膠表面播種細胞后,立即將載玻片放入顯微鏡的培養室中,并開始延時記錄。每 10 分鐘記錄一張圖像,使用基于軟件的工具在每個時間點調整焦點。或者,如果您的顯微鏡上沒有孵化室,則每小時記錄一次圖像,至少在前 8 - 10 小時內。記錄每個圖像后立即將樣品放入細胞培養箱中。在過夜培養后記錄最終圖像。
最后,分析圖像并使用合適的軟件可視化曲線。參數(例如,總管長)的時間曲線通常如下圖所示。曲線上升到最大值(約 5 小時),然后下降到平均期(約 7 小時開始),然后慢慢變平(> 20 小時)。由于所有四個關鍵參數的特征看起來相似,只評估一個參數就足夠了。我們選擇管總長度作為參數,因為原始圖像提供了一個控制,可以輕松地與評估圖像進行比較。
24小時內管長的時間響應
最佳結果出現在最大階段以及不會迅速下降的穩定階段。在上例中,4 小時時間點和 10 小時時間點是很好的測量參考點。
2.1.2. 細胞接種密度
要確定最佳細胞接種密度,請記錄細胞系的特征。
首先,在 5-40 x 10 3cells/ml 范圍內進行一系列稀釋,然后將細胞接種到凝膠表面。按照第 4.1.1 節中的說明將樣品孵育確定的時間長度,并記錄相襯圖像。每個細胞濃度執行五次重復。
評估圖像,分別在第 3 節和第 5 節中提到。將數據可視化為圖表,如下所示。數據將顯示具有最大值的特性曲線。該最大值是您的細胞類型的*佳接種密度。
HUVEC 和 EA.hy926接種4小時后的密度響應
2.1.3. 血清濃度
向培養基中添加血清可能會影響試管形成行為。在大多數情況下,血清抑制管形成。為避免此問題,請使用您在第 4.1.1 節和第 4.1.2 節中確定的條件測試不同的血清濃度,范圍為 0 - 20%。這將確定哪種血清濃度適合于血管生成和細胞存活。
2.1.4. 放大倍數
放大倍數決定了能夠被相機成像的孔區域。由于管的形成發生在孔的整個表面區域,重要的是盡可能地對最寬的部分進行成像。如果不需要檢測細胞內細節,請使用低倍率(4 倍或 5 倍)。如果需要檢測細胞內細節,建議對每個孔拍攝幾張放大倍數更高的圖像并將它們拼接在一起
2.2. 建立陽性和陰性對照
要創建陽性對照,請選擇確保血管形成的實驗系統(例如,具有減少生長因子的基質膠TM值和用于 HUVEC 的無血清培養基)。陽性對照確保細胞是健康的,并且觀察到的任何抗血管生成作用都是由所研究的物質引起的。
要創建陰性對照,請選擇一種經證實對血管形成發展具有抑制作用的物質(例如,用于 HUVEC 的蘇拉胺)。陰性對照確保可以抑制細胞中的管形成,并為您的實驗結果提供一個比較點。
2.3. 實驗計劃和重復次數
在進行實驗之前,計算所需材料的數量,例如細胞、培養基、凝膠基質和物質。還要計算實驗室設備和空間要求以及時間表。
為了正確地進行統計分析,建議至少進行四次獨立實驗,每個實驗至少有 8 個單孔。所需的實驗次數取決于數據的均勻性。遵循嚴格的協議對于數據采集至關重要。
對數據集執行學生 T 檢驗。p 值 ≤ 0.05* (≤ 0.01**) 表示該模型有足夠的功效,無需額外實驗即可繼續。
2.4. 文檔
合理的文檔包括本節中確定的所有參數。生成一個表格圖表,其中每個實驗都記錄在一列中。附錄中給出了一個例子。
3.數據分析
每個分析孔生成一個管長度值。然后將一個實驗(每個條件至少 8 個孔)的值相加并計算標準偏差。標準偏差應小于 10%。這只是一個實驗數據點。
左圖顯示了在四個不同時間點,一種實驗條件下單孔結果的分布。右圖顯示了一種實驗條件在四個不同時間點的平均結果。
為了正確穩定的統計分析,每個條件至少需要四個數據點。請記住,每個數據點由 8 個單獨的孔組成?! ?/p>
單個數據點合并為一個平均值,并可以顯示在條形圖中。統計分析是通過學生 T 檢驗完成的,其中對不同的數據點群體進行相互檢驗。